提示词描述

技术平台搭建：SILAC标记和蛋白冠交换方法 1. 细胞SILAC标记：首先，使用重型赖氨酸和精氨酸对Raw 264.7细胞进行SILAC标记。经过五代培养后，细胞被重型标记。随后，提取全细胞裂解液，并通过质谱确认同位素标记的成功。 2. 蛋白冠交换方法搭建：建立了一种分析同质和异质蛋白冠交换的方法。使用两种类型的纳米颗粒（Fe₃O₄@SiO₂ NPs和Fe₃O₄ NPs）来建立该方法。在同质交换中，纳米颗粒首先与未标记的细胞裂解液孵育1小时，形成蛋白冠1（PC1）。然后将PC1转移到重型标记的裂解液中，孵育1小时以形成蛋白冠2（PC2）。通过质谱鉴定从PC1交换到PC2的蛋白质（通过观察重型标记蛋白质的比例）。在异质交换中，纳米颗粒首先与血清孵育以形成蛋白冠1（PC1）。然后将PC1转移到重型标记的裂解液中以形成蛋白冠2（PC2）。通过质谱鉴定从PC1交换到PC2的蛋白质（通过观察重型标记蛋白质的比例）。分析来自不同组的同质和异质交换的蛋白质，对照组包括与未标记裂解液孵育以形成蛋白冠的纳米颗粒和与血清孵育以形成蛋白冠的纳米颗粒。 应用1：使用邻近标记技术分析“软冠”和“硬冠”的交换动力学 3. 应用场景1涉及结合邻近标记技术来定义“软冠”和“硬冠”。具体而言，设置对照组以鉴定交换的硬冠蛋白。例如，在同质交换中，纳米颗粒与未标记的细胞裂解液孵育以形成蛋白冠1，用缓冲液洗涤两次以去除软冠蛋白，然后将洗涤后的硬冠转移到重型标记的裂解液中，孵育1小时以形成蛋白冠2（PC2），并用缓冲液洗涤两次以去除软冠蛋白。随后，进行质谱分析以鉴定交换的硬冠蛋白。在异质组中执行相同的程序。对于实验组，在形成蛋白冠2时进行邻近标记。纳米颗粒首先与未标记的细胞裂解液孵育以形成蛋白冠1，然后将重型标记的裂解液添加到PC1中。在不同的孵育时间点（5、10、20、45、60、90、120、200、300秒），启动邻近标记（通过添加生物素酚和过氧化氢）。添加SA磁珠以富集生物素化蛋白质，然后进行质谱分析。在不同的时间点跟踪交换的硬冠蛋白。绘制每种蛋白质的交换动力学曲线和半衰期。还量化了邻近标记的标记距离。 4. 从定性描述到定量分析软蛋白冠：在同质交换中进行软蛋白冠分析。使用甲醛固定来固定软蛋白冠，以确定蛋白冠交换过程中交换的软蛋白冠。具体而言，纳米颗粒与裂解液孵育以形成蛋白冠1。