提示詞描述

技術平台建立：SILAC標記與蛋白質冠交換方法 1. 細胞SILAC標記：首先，使用重型離胺酸和精胺酸對Raw 264.7細胞進行SILAC標記。經過五代培養後，細胞被重型標記。隨後，提取全細胞裂解液，並通過質譜分析確認同位素標記的成功。 2. 蛋白質冠交換方法建立：建立了一種分析同質和異質蛋白質冠交換的方法。使用兩種奈米粒子（Fe₃O₄@SiO₂ NPs和Fe₃O₄ NPs）來建立該方法。在同質交換中，奈米粒子首先與未標記的細胞裂解液孵育1小時，以形成蛋白質冠1（PC1）。然後將PC1轉移到重型標記的裂解液中並孵育1小時，以形成蛋白質冠2（PC2）。通過質譜分析鑑定從PC1交換到PC2的蛋白質（通過觀察重型標記蛋白質的比例）。在異質交換中，奈米粒子首先與血清孵育以形成蛋白質冠1（PC1）。然後將PC1轉移到重型標記的裂解液中以形成蛋白質冠2（PC2）。通過質譜分析鑑定從PC1交換到PC2的蛋白質（通過觀察重型標記蛋白質的比例）。分析來自不同組的同質和異質交換的蛋白質，對照組包括與未標記的裂解液孵育以形成蛋白質冠的奈米粒子，以及與血清孵育以形成蛋白質冠的奈米粒子。 應用1：使用鄰近標記技術分析「軟冠」和「硬冠」的交換動力學 3. 應用場景1涉及與鄰近標記技術結合，以定義「軟冠」和「硬冠」。具體而言，建立一個對照組以鑑定交換的硬冠蛋白質。例如，在同質交換中，奈米粒子與未標記的細胞裂解液孵育以形成蛋白質冠1，用緩衝液洗滌兩次以去除軟冠蛋白質，然後將洗滌後的硬冠轉移到重型標記的裂解液中，孵育1小時以形成蛋白質冠2（PC2），並用緩衝液洗滌兩次以去除軟冠蛋白質。隨後，進行質譜分析以鑑定交換的硬冠蛋白質。在異質組中執行相同的程序。對於實驗組，在形成蛋白質冠2時進行鄰近標記。奈米粒子首先與未標記的細胞裂解液孵育以形成蛋白質冠1，然後將重型標記的裂解液添加到PC1中。在不同的孵育時間點（5、10、20、45、60、90、120、200、300秒），啟動鄰近標記（通過添加生物素酚和過氧化氫）。添加SA磁珠以富集生物素化蛋白質，然後進行質譜分析。在不同的時間點追蹤交換的硬冠蛋白質。繪製每種蛋白質的交換動力學曲線和半衰期。還量化了鄰近標記的標記距離。 4. 從軟蛋白質冠的定性描述到定量分析：在同質交換中進行軟蛋白質冠分析。使用甲醛固定固定軟蛋白質冠，以確定蛋白質冠交換過程中交換的軟蛋白質冠。具體而言，奈米粒子與裂解液孵育以形成蛋白質冠1。