Описание промпта

Создание технической платформы: SILAC-мечение и методология обмена белковой короны 1. SILAC-мечение клеток: Сначала клетки Raw 264.7 метили по SILAC с использованием тяжелого лизина и аргинина. После пяти поколений культивирования клетки были тяжело мечены. Впоследствии были экстрагированы лизаты целых клеток, и успех изотопного мечения был подтвержден масс-спектрометрией. 2. Создание методологии обмена белковой короны: Была разработана методология для анализа как гомогенного, так и гетерогенного обмена белковой короны. Для создания методологии использовались два типа наночастиц (Fe₃O₄@SiO₂ NPs и Fe₃O₄ NPs). В гомогенном обмене наночастицы сначала инкубировали с немеченым клеточным лизатом в течение 1 часа для формирования белковой короны 1 (PC1). Затем PC1 переносили в тяжело меченый лизат и инкубировали в течение 1 часа для формирования белковой короны 2 (PC2). Белки, обмененные из PC1 в PC2, идентифицировали с помощью масс-спектрометрии (путем наблюдения за долей тяжело меченых белков). В гетерогенном обмене наночастицы сначала инкубировали с сывороткой для формирования белковой короны 1 (PC1). Затем PC1 переносили в тяжело меченый лизат для формирования белковой короны 2 (PC2). Белки, обмененные из PC1 в PC2, идентифицировали с помощью масс-спектрометрии (путем наблюдения за долей тяжело меченых белков). Анализировали белки из разных групп гомогенного и гетерогенного обмена, при этом контрольные группы состояли из наночастиц, инкубированных с немеченым лизатом для формирования белковой короны, и наночастиц, инкубированных с сывороткой для формирования белковой короны. Применение 1: Анализ кинетики обмена "мягкой короны" и "жесткой короны" с использованием технологии проксимити-мечения 3. Сценарий применения 1 включает объединение с технологией проксимити-мечения для определения "мягкой короны" и "жесткой короны". В частности, была создана контрольная группа для идентификации обмененных белков жесткой короны. Например, в гомогенном обмене наночастицы инкубировали с немеченым клеточным лизатом для формирования белковой короны 1, дважды промывали буфером для удаления белков мягкой короны, а затем промытую жесткую корону переносили в тяжело меченый лизат, инкубировали в течение 1 часа для формирования белковой короны 2 (PC2) и дважды промывали буфером для удаления белков мягкой короны. Впоследствии проводили масс-спектрометрию для идентификации обмененных белков жесткой короны. Та же процедура была выполнена в гетерогенной группе. Для экспериментальной группы проксимити-мечение проводили при формировании белковой короны 2. Наночастицы сначала инкубировали с немеченым клеточным лизатом для формирования белковой короны 1, а затем к PC1 добавляли тяжело меченый лизат. В разные моменты времени инкубации (5, 10, 20, 45, 60, 90, 120, 200, 300 с) инициировали проксимити-мечение (путем добавления биотин-фенола и перекиси водорода). Добавляли SA-магнитные шарики для обогащения биотинилированных белков, после чего проводили масс-спектрометрический анализ. Отслеживали обмененные белки жесткой короны в разные моменты времени. Для каждого белка строили кривые кинетики обмена и определяли периоды полураспада. Также количественно определяли расстояние мечения проксимити-мечения. 4. От качественного описания к количественному анализу мягкой белковой короны: Анализ мягкой белковой короны проводили в гомогенном