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Hibridização de mutantes de Nicotiana benthamiana para produzir mutantes homozigotos.

Biomédico

Descrição do Prompt

Hibridização de mutantes de Nicotiana benthamiana para produzir mutantes homozigotos.

Ilustrações Relacionadas

Representação esquemática de quatro genes chave envolvidos em vias de destoxificação e estresse oxidativo associadas à suscetibilidade ao câncer de próstata. A figura destaca TXNRD2 como o principal gene candidato, envolvido na homeostase redox mitocondrial e no controle de danos oxidativos, mostrando evidências de associação em uma coorte de replicação independente. NFE2L2 (NRF2) é representado como o regulador mestre da resposta antioxidante; a expressão reduzida no tecido tumoral da próstata leva à ativação prejudicada de genes citoprotetores. ARNT é mostrado como um cofator transcricional na destoxificação de xenobióticos e em vias relacionadas à hipóxia, afetando potencialmente a angiogênese e a reprogramação metabólica no câncer de próstata. GPX6 é incluído como uma selenoproteína envolvida na destoxificação de peróxidos e na sinalização redox, com um papel mais exploratório no câncer de próstata. No geral, a figura ilustra a convergência desses genes no controle do estresse oxidativo e nos processos de destoxificação relevantes para o câncer de próstata.

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Durante a fase de expressão, um indutor é adicionado para iniciar a expressão da proteína. Por exemplo, o IPTG, comumente usado, pode induzir a expressão eficiente de genes que carregam o promotor T7; métodos de produção antigos também usavam o promotor triptofano (promotor trp), que expressa automaticamente o precursor da insulina após a depleção de triptofano. Em resumo, otimizando as condições de expressão e as formulações do meio de cultura, altos níveis de cadeia A e cadeia B da insulina (ou proteína precursora) podem ser obtidos em E. coli.

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A preparação da insulina humana recombinante começa com o design e a síntese do gene da insulina humana. A insulina humana consiste em duas cadeias peptídicas, A e B; portanto, dois genes sintéticos são tipicamente projetados: um codificando a cadeia A e outro codificando a cadeia B. Pesquisadores otimizam códons preferidos por *E. coli* com base na sequência natural de aminoácidos da insulina e sintetizam quimicamente esses dois segmentos de gene. Em seguida, enzimas de restrição são usadas para inserir o gene da cadeia A ou da cadeia B em um plasmídeo vetor, construindo um plasmídeo de expressão recombinante. O plasmídeo também precisa conter elementos funcionais, como promotores e terminadores, e marcadores de resistência a antibióticos para alcançar transcrição e seleção eficientes do gene. Vetores de expressão comumente usados geralmente carregam promotores fortes (como promotores T7 ou triptofano) e RBS para impulsionar a expressão em alto nível do gene inserido na bactéria hospedeira.

Aqui, os genes A e B são clonados separadamente em plasmídeos circulares. Como mostrado na ilustração, o gene da pró-insulina (contendo sequências das cadeias A e B) é extraído do núcleo celular no canto superior esquerdo; o plasmídeo circular aberto com enzimas de restrição está no canto superior direito, e o vetor contém um promotor e um gene de resistência. Após a reação enzimática, o gene da cadeia A e o gene da cadeia B são ligados em diferentes sítios no plasmídeo, formando um plasmídeo recombinante para expressão downstream.

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