Descrição do Prompt

Estabelecimento da Plataforma Técnica: Marcação SILAC e Metodologia de Troca da Coroa de Proteínas 1. Marcação SILAC de Células: Primeiramente, células Raw 264.7 foram marcadas com SILAC utilizando lisina e arginina pesadas. Após cinco gerações de cultura, as células foram fortemente marcadas. Subsequentemente, lisados de células inteiras foram extraídos, e o sucesso da marcação isotópica foi confirmado por espectrometria de massas. 2. Estabelecimento da Metodologia de Troca da Coroa de Proteínas: Uma metodologia foi estabelecida para analisar a troca de coroa de proteínas homogênea e heterogênea. Dois tipos de nanopartículas (NPs de Fe₃O₄@SiO₂ e NPs de Fe₃O₄) foram usados para estabelecer a metodologia. Na troca homogênea, as nanopartículas foram primeiramente incubadas com lisado celular não marcado por 1 hora para formar a coroa de proteínas 1 (CP1). A CP1 foi então transferida para lisado marcado com isótopos pesados e incubada por 1 hora para formar a coroa de proteínas 2 (CP2). As proteínas trocadas da CP1 para a CP2 foram identificadas por espectrometria de massas (observando a proporção de proteínas marcadas com isótopos pesados). Na troca heterogênea, as nanopartículas foram primeiramente incubadas com soro para formar a coroa de proteínas 1 (CP1). A CP1 foi então transferida para lisado marcado com isótopos pesados para formar a coroa de proteínas 2 (CP2). As proteínas trocadas da CP1 para a CP2 foram identificadas por espectrometria de massas (observando a proporção de proteínas marcadas com isótopos pesados). As proteínas de diferentes grupos de trocas homogêneas e heterogêneas foram analisadas, com grupos de controle consistindo em nanopartículas incubadas com lisado não marcado para formar uma coroa de proteínas e nanopartículas incubadas com soro para formar uma coroa de proteínas. Aplicação 1: Análise da Cinética de Troca da "Coroa Mole" e "Coroa Dura" Usando a Tecnologia de Marcação por Proximidade 3. O cenário de aplicação 1 envolve a combinação com a tecnologia de marcação por proximidade para definir a "coroa mole" e a "coroa dura". Especificamente, um grupo de controle foi estabelecido para identificar as proteínas da coroa dura trocadas. Por exemplo, na troca homogênea, as nanopartículas foram incubadas com lisado celular não marcado para formar a coroa de proteínas 1, lavadas duas vezes com tampão para remover as proteínas da coroa mole, e então a coroa dura lavada foi transferida para lisado marcado com isótopos pesados, incubada por 1 hora para formar a coroa de proteínas 2 (CP2), e lavada duas vezes com tampão para remover as proteínas da coroa mole. Subsequentemente, a espectrometria de massas foi realizada para identificar as proteínas da coroa dura trocadas. O mesmo procedimento foi realizado no grupo heterogêneo. Para o grupo experimental, a marcação por proximidade foi realizada quando a coroa de proteínas 2 foi formada. As nanopartículas foram primeiramente incubadas com lisado celular não marcado para formar a coroa de proteínas 1, e então lisado marcado com isótopos pesados foi adicionado à CP1. Em diferentes pontos de tempo de incubação (5, 10, 20, 45, 60, 90, 120, 200, 300 s), a marcação por proximidade foi iniciada (adicionando biotina fenol e peróxido de hidrogênio). Esferas magnéticas SA foram adicionadas para enriquecer proteínas biotiniladas, seguido por análise de espectrometria de massas. As proteínas da coroa dura trocadas foram rastreadas em diferentes pontos de tempo. Curvas cinéticas de troca e meias-vidas foram plotadas para cada proteína. A distância de marcação da marcação por proximidade também foi quantificada. 4. Da Descrição Qualitativa à Análise Quantitativa da Coroa de Proteínas Mole: A análise da coroa de proteínas mole foi realizada na troca homogênea. A coroa de proteínas mole foi fixada usando fixação com formaldeído para determinar a coroa de proteínas mole trocada durante o processo de troca da coroa de proteínas. Especific