Descrição do Prompt

**Título:** Dissecando as Interações de Proteínas do Hospedeiro que Mediam a Fuga Lisossomal de LNPs Usando a Tecnologia de Marcação por Proximidade **Questões Científicas Chave:** 1. Como os componentes lipídicos das LNPs influenciam especificamente sua eficiência de fuga lisossomal? Existem características estruturais lipídicas chave que determinam a eficiência da fuga? 2. Quais proteínas da célula hospedeira interagem funcionalmente com as LNPs nos nós espaço-temporais críticos da fuga lisossomal? Como essas proteínas interagentes mediam ou dificultam o processo de fuga? **Métodos de Pesquisa:** Primeiro, uma biblioteca de lipídios multicomponente será construída e rastreada em células LLC-luc usando o sistema repórter Siluc para identificar LNPs de "alta fuga" e "baixa fuga" com eficiências de fuga lisossomal significativamente diferentes. A localização subcelular das LNPs será rastreada dinamicamente usando microscopia confocal para determinar precisamente sua janela de tempo de fuga. Subsequentemente, no ponto de tempo crítico da fuga, a tecnologia de marcação por proximidade fotoativada por Ce6 será usada para marcar espaço-temporalmente as proteínas do hospedeiro próximas às LNPs, e grupos de proteínas interagentes serão identificados por análise de espectrometria de massas. Proteínas regulatórias candidatas serão rastreadas comparando as proteínas interagentes diferenciais de LNPs de alta e baixa fuga. Finalmente, a tecnologia de nocaute genético CRISPR-Cas9 será usada para verificar o papel funcional de proteínas chave na fuga lisossomal de LNPs. **Conclusões Esperadas:** Espera-se que este estudo estabeleça um mapa de correlação direta entre a composição lipídica das LNPs e a eficiência de fuga lisossomal, revelando características químicas lipídicas chave que afetam a eficiência da fuga. Pela primeira vez, a rede de interação dinâmica entre as LNPs e as proteínas do hospedeiro será capturada no nó espaço-temporal preciso da fuga lisossomal, e vários fatores chave do hospedeiro (como proteínas de fusão de membrana específicas, proteínas de transferência de lipídios ou canais iônicos) que mediam ou dificultam o processo de fuga serão identificados. Essas descobertas elucidarão o mecanismo molecular da fuga lisossomal de LNPs, fornecerão uma base teórica e novos alvos de engenharia para o design racional de sistemas de entrega eficientes e promoverão o desenvolvimento da tecnologia de entrega de fármacos de ácido nucleico.