Descrição do Prompt

2.2 Elucidar os principais mecanismos moleculares da ação da polifilina III em diferentes subtipos de células de câncer de mama. ① Com base nos resultados anteriores de diferença de sensibilidade, selecionar quatro linhagens celulares: MCF-7 (Luminal A), BT-474 (Luminal B), SK-BR-3 (HER2-enriquecido) e MDA-MB-231 (TNBC). Utilizar a tecnologia de RNA-seq para comparar sistematicamente as alterações do transcriptoma de cada subtipo antes e após o tratamento com polifilina III. Concentrar-se no enriquecimento de apoptose, estresse oxidativo e vias de sinalização específicas do subtipo (como ER, HER2, STAT3) e rastrear genes-chave diferencialmente expressos. Combinar Western blotting e qRT-PCR para verificar as alterações de expressão de alvos candidatos (como membros da família Bcl-2, NOXA, PUMA, EGFR, p-STAT3, etc.) e identificar as moléculas efetoras centrais com a resposta mais significativa em cada subtipo. ② Realizar experimentos de intervenção funcional visando os mecanismos dominantes de cada subtipo: Em TNBC, estabelecer um grupo controle, um grupo polifilina III, um grupo NAC (removedor de ROS) e um grupo polifilina III + NAC para detectar apoptose (Caspase-3/PARP clivada), níveis de ROS, potencial de membrana mitocondrial e status de fosforilação de JNK/p38. Em células HER2⁺, estabelecer um grupo controle, um grupo polifilina III e um grupo de superexpressão/silenciamento de HER2 para avaliar a atividade da via HER2-AKT/ERK e a taxa de sobrevivência celular. Em células Luminal A, combinar inibidores de ER (fulvestranto) ou siRNA de ERα para observar se a resistência ao medicamento é revertida. Ao mesmo tempo, avaliar as alterações fenotípicas funcionais através de citometria de fluxo Annexin V/PI, análise do ciclo celular e experimentos de scratch/Transwell. ③ Construir linhagens celulares estáveis de nocaute ou superexpressão de genes de nódulos-chave (como HIF-1α, STAT3 ou HER2) para verificar sua necessidade na morte celular induzida por polifilina III, inibição de sinal e alterações fenotípicas, e detectar a ubiquitinação de proteínas relacionadas ou alterações de localização subcelular, estabelecendo assim o eixo molecular central que impulsiona as diferenças de eficácia do medicamento em cada subtipo.