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기술 플랫폼 구축: SILAC 표지 및 단백질 코로나 교환 방법론 1. 세포 SILAC 표지: 먼저 Raw 264.7 세포를 중(重) 라이신과 아르기닌을 사용하여 SILAC 표지했습니다. 5세대 배양 후 세포는 완전히 중표지되었습니다. 이후, 전체 세포 용해물을 추출하고, 동위원소 표지의 성공 여부를 질량 분석법으로 확인했습니다. 2. 단백질 코로나 교환 방법론 구축: 동종 및 이종 단백질 코로나 교환을 분석하기 위한 방법론을 구축했습니다. 두 종류의 나노 입자(Fe₃O₄@SiO₂ NPs 및 Fe₃O₄ NPs)를 사용하여 방법론을 구축했습니다. 동종 교환에서는 나노 입자를 먼저 비표지 세포 용해물과 1시간 동안 배양하여 단백질 코로나 1 (PC1)을 형성했습니다. PC1을 중표지 용해물로 옮겨 1시간 동안 배양하여 단백질 코로나 2 (PC2)를 형성했습니다. PC1에서 PC2로 교환된 단백질은 질량 분석법으로 확인했습니다 (중표지 단백질의 비율 관찰). 이종 교환에서는 나노 입자를 먼저 혈청과 배양하여 단백질 코로나 1 (PC1)을 형성했습니다. PC1을 중표지 용해물로 옮겨 단백질 코로나 2 (PC2)를 형성했습니다. PC1에서 PC2로 교환된 단백질은 질량 분석법으로 확인했습니다 (중표지 단백질의 비율 관찰). 동종 및 이종 교환의 서로 다른 그룹의 단백질을 분석했으며, 대조군은 비표지 용해물과 배양하여 단백질 코로나를 형성한 나노 입자와 혈청과 배양하여 단백질 코로나를 형성한 나노 입자로 구성되었습니다. 응용 1: 근접 표지 기술을 이용한 "소프트 코로나" 및 "하드 코로나"의 교환 역학 분석 3. 응용 시나리오 1은 근접 표지 기술과 결합하여 "소프트 코로나"와 "하드 코로나"를 정의하는 것입니다. 구체적으로, 교환된 하드 코로나 단백질을 식별하기 위해 대조군을 설정했습니다. 예를 들어, 동종 교환에서 나노 입자를 비표지 세포 용해물과 배양하여 단백질 코로나 1을 형성하고, 완충액으로 두 번 세척하여 소프트 코로나 단백질을 제거한 다음, 세척된 하드 코로나를 중표지 용해물로 옮겨 1시간 동안 배양하여 단백질 코로나 2 (PC2)를 형성하고, 완충액으로 두 번 세척하여 소프트 코로나 단백질을 제거했습니다. 이후, 질량 분석법을 수행하여 교환된 하드 코로나 단백질을 식별했습니다. 이종 그룹에서도 동일한 절차를 수행했습니다. 실험군에서는 단백질 코로나 2가 형성될 때 근접 표지를 수행했습니다. 나노 입자를 먼저 비표지 세포 용해물과 배양하여 단백질 코로나 1을 형성한 다음, PC1에 중표지 용해물을 첨가했습니다. 서로 다른 배양 시간 (5, 10, 20, 45, 60, 90, 120, 200, 300 초)에 근접 표지를 시작했습니다 (비오틴 페놀과 과산화수소 첨가). SA 자성 비드를 첨가하여 비오틴화된 단백질을 농축하고, 질량 분석 분석을 수행했습니다. 교환된 하드 코로나 단백질을 서로 다른 시간대에 추적했습니다. 각 단백질에 대한 교환 역학 곡선과 반감기를 플롯했습니다. 근접 표지의 표지 거리도 정량화했습니다. 4. 소프트 단백질 코로나의 질적 설명에서 정량적 분석으로: 동종 교환에서 소프트 단백질 코로나 분석을 수행했습니다. 포름알데히드 고정을 사용하여 소프트 단백질 코로나를 고정하여 단백질 코로나 교환 과정에서 교환된 소프트 단백질 코로나를 결정했습니다. 구체적으로, 나노 입자를 용해물과 배양하여 단백질 코로나 1을 형성했습니다.