
1. 動物モデルの構築と群分け投与 1.1 モデリング試薬の準備 ウシII型コラーゲン:免疫原性のある天然構造を持つコラーゲン、純度95%以上の凍結乾燥粉末。 コンプリートフロイントアジュバント 氷酢酸:分析グレード、コラーゲン溶媒。 1.2 動物の選択と倫理 ウィスター系雌ラット、6-8週齢、体重160-200gを選択(ウィスター系ラットはコラーゲン誘発性関節炎に対する感受性が高く、発症率が高い。ウィスター系ラットが入手できない場合は、SDラットを代用可能)。1群あたり10-12匹のラットを使用し、モデルの失敗の可能性を考慮して、モデリング群の数を適宜増やすことができる。SPFグレードの動物室、温度22±2℃、相対湿度55±5%、12時間明暗サイクル、7日間の馴化飼育。動物実験開始前に倫理的承認を得る必要がある。 1.3 CIAモデル誘導プロトコル a. コラーゲン溶液の調製:無菌条件下で、ウシII型コラーゲン凍結乾燥粉末を0.05 Mまたは0.1 Mの氷酢酸に溶解し、最終濃度2 mg/mLとする。このステップは4℃で一晩かけてゆっくりと攪拌しながら行い、コラーゲンの変性を防ぐために激しい振とうは避ける。溶解したコラーゲン溶液は、透明またはわずかに乳白色である必要がある。 b. エマルジョン調製:氷浴条件下で、コラーゲン溶液と等量のコンプリートフロイントアジュバントを混合し、乳化させる(高速組織ホモジナイザーを使用するか、三方活栓を介して2本のガラスシリンジで繰り返し押し引きする)。 c. 初回免疫:ラットを吸入麻酔(イソフルラン)した後、背中を剃毛し、消毒する。注射部位:尾根背側の皮内多点注射。 d. 追加免疫:初回免疫の7日後に、初回免疫と同じ用量で追加免疫を行う。元の注射部位は避ける。 1.4 群分けと投与プロトコル ラットは初回免疫後10-14日で関節の赤みや腫れの症状を示し始める。この時点で、関節炎スコアまたは体重に基づいてラットをランダムに群分けし、群間のベースラインの一貫性を確保する。 ゲンチアナ・マクロフィラ抽出物は、100 mg/kgの用量で有意な抗炎症効果を示している。明確な用量反応関係を観察し、代謝調節の閾値をカバーするために、100、200、および400 mg/kgの3つの段階を設計した。抽出物は0.5%カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液に懸濁し、モデリング後14日目から投与を開始し、42日目まで28日間継続する。 群 サンプルサイズ 薬物 投与量 投与経路/頻度 ブランクコントロール群 10 0.9%生理食塩水または0.5% CMC-Na 等量 経口投与/1日1回 モデル群 12 上記と同様 等量 経口投与/1日1回 陽性コントロール群 10 メトトレキサート 3mg/kg 経口投与/週2回 低用量ゲンチアナ・マクロフィラ群 10 ゲンチアナ・マクロフィラエタノール抽出物 100mg/kg 経口投与/1日1回 中用量ゲンチアナ・マクロフィラ群 10 ゲンチアナ・マクロフィラエタノール抽出物 200mg/kg 経口投与/1日1回 高用量ゲンチアナ・マクロフィラ群 10 ゲンチアナ・マクロフィラエタノール抽出物 400mg/kg 経口投与/1日1回 2. 薬力学的評価セクション 2.1 関節炎スコアと腫脹度(肉眼的) a. 観察頻度:〜から