Promptの説明

技術プラットフォームの確立：SILACラベリングおよびプロテインコロナ交換手法 1. 細胞SILACラベリング：まず、Raw 264.7細胞を重いリジンとアルギニンを用いてSILAC標識した。5世代培養後、細胞は重く標識された。その後、全細胞溶解物を抽出し、質量分析により同位体標識の成功を確認した。 2. プロテインコロナ交換手法の確立：均一および不均一なプロテインコロナ交換を分析するための手法を確立した。二種類のナノ粒子（Fe₃O₄@SiO₂ NPsおよびFe₃O₄ NPs）を用いて手法を確立した。均一交換では、ナノ粒子をまず非標識細胞溶解物と1時間インキュベートし、プロテインコロナ1（PC1）を形成した。PC1を次に重標識溶解物に移し、1時間インキュベートしてプロテインコロナ2（PC2）を形成した。PC1からPC2へ交換されたタンパク質は、質量分析により（重標識タンパク質の割合を観察することで）同定した。不均一交換では、ナノ粒子をまず血清とインキュベートし、プロテインコロナ1（PC1）を形成した。PC1を次に重標識溶解物に移し、プロテインコロナ2（PC2）を形成した。PC1からPC2へ交換されたタンパク質は、質量分析により（重標識タンパク質の割合を観察することで）同定した。均一および不均一交換の異なるグループからのタンパク質を分析し、対照群は、ナノ粒子を非標識溶解物とインキュベートしてプロテインコロナを形成したもの、およびナノ粒子を血清とインキュベートしてプロテインコロナを形成したものとした。 応用1：近接標識技術を用いた「ソフトコロナ」と「ハードコロナ」の交換速度の分析 3. 応用シナリオ1では、近接標識技術と組み合わせて「ソフトコロナ」と「ハードコロナ」を定義する。具体的には、交換されたハードコロナタンパク質を同定するために、対照群を設定した。例えば、均一交換では、ナノ粒子を非標識細胞溶解物とインキュベートしてプロテインコロナ1を形成し、バッファーで2回洗浄してソフトコロナタンパク質を除去し、次に洗浄されたハードコロナを重標識溶解物に移し、1時間インキュベートしてプロテインコロナ2（PC2）を形成し、バッファーで2回洗浄してソフトコロナタンパク質を除去した。その後、質量分析を行い、交換されたハードコロナタンパク質を同定した。不均一グループでも同様の手順を行った。実験グループでは、プロテインコロナ2が形成されたときに近接標識を行った。ナノ粒子をまず非標識細胞溶解物とインキュベートしてプロテインコロナ1を形成し、次に重標識溶解物をPC1に添加した。異なるインキュベーション時間（5、10、20、45、60、90、120、200、300秒）で、近接標識を開始した（ビオチンフェノールと過酸化水素を添加することによって）。SA磁気ビーズを添加してビオチン化タンパク質を濃縮し、続いて質量分析を行った。交換されたハードコロナタンパク質を異なる時点で追跡した。各タンパク質の交換速度曲線と半減期をプロットした。近接標識の標識距離も定量化した。 4. ソフトプロテインコロナの定性的な記述から定量的な分析へ：均一交換において、ソフトプロテインコロナの分析を行った。ホルムアルデヒド固定を用いてソフトプロテインコロナを固定し、プロテインコロナ交換プロセス中に交換されたソフトプロテインコロナを決定した。具体的には、ナノ粒子を溶解物とインキュベートしてプロテインコロナ1を形成した。