Fase 1: Selezione della piattaforma (ceppo LAB) Obiettivo: Selezionare un ceppo "chassis" ben caratterizzato, noto per l'alta produttività e la facilità di manipolazione, garantendo la massima efficienza nelle successive modifiche. Vantaggio tecnico: Sfruttando i dati completi del genoma e i dati multi-omici più recenti, trasformiamo la tradizionale piattaforma empirica "user-friendly" in un sistema modello digitalizzato con informazioni trasparenti, consentendo una progettazione precisa. (Tabella comparativa della morfologia del RE) - Dimostra visivamente gli effetti diretti e i principi fondamentali dell'ingegneria del RE (modifica della piattaforma). Fase 2: Identificazione del bersaglio (gene CCT) Obiettivo: Identificare l'interruttore chiave che controlla le dimensioni del "laboratorio di produzione" (reticolo endoplasmatico). L'aumento della produzione di SIgA implica l'ottimizzazione dell'ambiente per il suo folding e assemblaggio piuttosto che l'amplificazione diretta del suo gene. Vantaggio tecnico: Dimostra la capacità di progettazione razionale. Basandosi sul chiaro principio biologico cellulare di "sintesi della membrana-espansione del RE", la bioinformatica viene utilizzata per localizzare con precisione i geni regolatori chiave da genomi massicci, evitando lo screening alla cieca. (Elenco dei bersagli e dei mutanti) - Elenca chiaramente tre geni bersaglio specifici (CCT1A, CCT1B, CCT2) e i loro ID genici, e mostra i mutanti con diverse combinazioni. Fase 3: Progettazione delle "forbici" (gRNA) Obiettivo: Eseguire un'editing preciso di "guadagno di funzione" piuttosto che di "perdita di funzione" sul bersaglio. L'obiettivo è consentire alle cellule di produrre continuamente più componenti della membrana, espandendo così naturalmente il RE, piuttosto che uccidere le cellule. Vantaggio tecnico: Rappresenta la precisione e la programmabilità della tecnologia di editing genico CRISPR/Cas9. La progettazione di gRNA per tagliare tra domini specifici consente la "messa a punto" della funzione proteica, che è difficile da ottenere con le tradizionali tecniche di sovraccarico transgenico o di knockout genico. (Grafico di verifica del sequenziamento dell'editing genico) - Conferma la precisione e l'efficacia dell'editing CRISPR sotto forma di "impronte molecolari".
Il plasmide ricombinante costruito viene introdotto in ceppi...