Descrizione del prompt

Realizzazione di una piattaforma tecnica: Marcatura SILAC e metodologia di scambio della corona proteica 1. Marcatura SILAC delle cellule: Innanzitutto, le cellule Raw 264.7 sono state marcate con SILAC utilizzando lisina e arginina pesanti. Dopo cinque generazioni di coltura, le cellule sono state pesantemente marcate. Successivamente, sono stati estratti lisati di cellule intere e il successo della marcatura isotopica è stato confermato mediante spettrometria di massa. 2. Realizzazione della metodologia di scambio della corona proteica: È stata realizzata una metodologia per analizzare lo scambio della corona proteica sia omogeneo che eterogeneo. Sono stati utilizzati due tipi di nanoparticelle (Fe₃O₄@SiO₂ NPs e Fe₃O₄ NPs) per realizzare la metodologia. Nello scambio omogeneo, le nanoparticelle sono state prima incubate con lisato cellulare non marcato per 1 ora per formare la corona proteica 1 (PC1). La PC1 è stata quindi trasferita in lisato marcato con isotopi pesanti e incubata per 1 ora per formare la corona proteica 2 (PC2). Le proteine scambiate da PC1 a PC2 sono state identificate mediante spettrometria di massa (osservando la proporzione di proteine marcate con isotopi pesanti). Nello scambio eterogeneo, le nanoparticelle sono state prima incubate con siero per formare la corona proteica 1 (PC1). La PC1 è stata quindi trasferita in lisato marcato con isotopi pesanti per formare la corona proteica 2 (PC2). Le proteine scambiate da PC1 a PC2 sono state identificate mediante spettrometria di massa (osservando la proporzione di proteine marcate con isotopi pesanti). Sono state analizzate le proteine provenienti da diversi gruppi di scambi omogenei ed eterogenei, con gruppi di controllo costituiti da nanoparticelle incubate con lisato non marcato per formare una corona proteica e nanoparticelle incubate con siero per formare una corona proteica. Applicazione 1: Analisi della cinetica di scambio della "corona soffice" e della "corona dura" utilizzando la tecnologia di marcatura di prossimità 3. Lo scenario applicativo 1 prevede la combinazione con la tecnologia di marcatura di prossimità per definire la "corona soffice" e la "corona dura". Nello specifico, è stato impostato un gruppo di controllo per identificare le proteine della corona dura scambiate. Ad esempio, nello scambio omogeneo, le nanoparticelle sono state incubate con lisato cellulare non marcato per formare la corona proteica 1, lavate due volte con tampone per rimuovere le proteine della corona soffice, e quindi la corona dura lavata è stata trasferita in lisato marcato con isotopi pesanti, incubata per 1 ora per formare la corona proteica 2 (PC2) e lavata due volte con tampone per rimuovere le proteine della corona soffice. Successivamente, è stata eseguita la spettrometria di massa per identificare le proteine della corona dura scambiate. La stessa procedura è stata eseguita nel gruppo eterogeneo. Per il gruppo sperimentale, la marcatura di prossimità è stata eseguita quando si è formata la corona proteica 2. Le nanoparticelle sono state prima incubate con lisato cellulare non marcato per formare la corona proteica 1, e quindi è stato aggiunto lisato marcato con isotopi pesanti alla PC1. A diversi punti temporali di incubazione (5, 10, 20, 45, 60, 90, 120, 200, 300 s), è stata avviata la marcatura di prossimità (aggiungendo biotina fenolo e perossido di idrogeno). Sono state aggiunte biglie magnetiche SA per arricchire le proteine biotinilate, seguite dall'analisi mediante spettrometria di massa. Le proteine della corona dura scambiate sono state tracciate a diversi punti temporali. Sono state tracciate le curve cinetiche di scambio e le emivite per ciascuna proteina. È stata anche quantificata la distanza di marcatura della marcatura di prossimità. 4. Dalla descrizione qualitativa all'analisi quantitativa della corona proteica soffice: L'analisi della corona proteica soffice è stata eseguita nello scambio omogeneo. La corona prote