Prompt-Beschreibung

Etablierung einer technischen Plattform: SILAC-Markierung und Methodik zum Austausch der Proteinkorona 1. Zell-SILAC-Markierung: Zuerst wurden Raw 264.7 Zellen mittels schwerem Lysin und Arginin SILAC-markiert. Nach fünf Kulturgenerationen waren die Zellen stark markiert. Anschließend wurden Gesamtzelllysate extrahiert und der Erfolg der Isotopenmarkierung mittels Massenspektrometrie bestätigt. 2. Etablierung einer Methodik zum Austausch der Proteinkorona: Eine Methodik wurde etabliert, um sowohl den homogenen als auch den heterogenen Austausch der Proteinkorona zu analysieren. Zwei Arten von Nanopartikeln (Fe₃O₄@SiO₂ NPs und Fe₃O₄ NPs) wurden verwendet, um die Methodik zu etablieren. Beim homogenen Austausch wurden Nanopartikel zuerst für 1 Stunde mit unmarkiertem Zelllysat inkubiert, um Proteinkorona 1 (PC1) zu bilden. PC1 wurde dann in schwer markiertes Lysat überführt und für 1 Stunde inkubiert, um Proteinkorona 2 (PC2) zu bilden. Aus PC1 in PC2 ausgetauschte Proteine wurden mittels Massenspektrometrie identifiziert (durch Beobachtung des Anteils schwer markierter Proteine). Beim heterogenen Austausch wurden Nanopartikel zuerst mit Serum inkubiert, um Proteinkorona 1 (PC1) zu bilden. PC1 wurde dann in schwer markiertes Lysat überführt, um Proteinkorona 2 (PC2) zu bilden. Aus PC1 in PC2 ausgetauschte Proteine wurden mittels Massenspektrometrie identifiziert (durch Beobachtung des Anteils schwer markierter Proteine). Proteine aus verschiedenen Gruppen von homogenen und heterogenen Austauschen wurden analysiert, wobei Kontrollgruppen aus Nanopartikeln bestanden, die mit unmarkiertem Lysat inkubiert wurden, um eine Proteinkorona zu bilden, und Nanopartikeln, die mit Serum inkubiert wurden, um eine Proteinkorona zu bilden. Anwendung 1: Analyse der Austauschkinetik von "Soft Corona" und "Hard Corona" unter Verwendung der Proximity-Labeling-Technologie 3. Anwendungsszenario 1 beinhaltet die Kombination mit der Proximity-Labeling-Technologie, um die "Soft Corona" und "Hard Corona" zu definieren. Speziell wurde eine Kontrollgruppe eingerichtet, um die ausgetauschten Hard-Corona-Proteine zu identifizieren. Zum Beispiel wurden beim homogenen Austausch Nanopartikel mit unmarkiertem Zelllysat inkubiert, um Proteinkorona 1 zu bilden, zweimal mit Puffer gewaschen, um Soft-Corona-Proteine zu entfernen, und dann wurde die gewaschene Hard Corona in schwer markiertes Lysat überführt, für 1 Stunde inkubiert, um Proteinkorona 2 (PC2) zu bilden, und zweimal mit Puffer gewaschen, um Soft-Corona-Proteine zu entfernen. Anschließend wurde eine Massenspektrometrie durchgeführt, um die ausgetauschten Hard-Corona-Proteine zu identifizieren. Das gleiche Verfahren wurde in der heterogenen Gruppe durchgeführt. Für die Experimentalgruppe wurde Proximity-Labeling durchgeführt, als Proteinkorona 2 gebildet wurde. Nanopartikel wurden zuerst mit unmarkiertem Zelllysat inkubiert, um Proteinkorona 1 zu bilden, und dann wurde schwer markiertes Lysat zu PC1 hinzugefügt. Zu verschiedenen Inkubationszeitpunkten (5, 10, 20, 45, 60, 90, 120, 200, 300 s) wurde das Proximity-Labeling initiiert (durch Zugabe von Biotinphenol und Wasserstoffperoxid). SA-Magnetbeads wurden hinzugefügt, um biotinylierte Proteine anzureichern, gefolgt von einer Massenspektrometrie-Analyse. Die ausgetauschten Hard-Corona-Proteine wurden zu verschiedenen Zeitpunkten verfolgt. Austauschkinetikkurven und Halbwertszeiten wurden für jedes Protein geplottet. Der Markierungsabstand des Proximity-Labelings wurde ebenfalls quantifiziert. 4. Von der qualitativen Beschreibung zur quantitativen Analyse der Soft-Proteinkorona: Die Soft-Proteinkorona-Analyse wurde im homogenen Austausch durchgeführt. Die Soft-Proteinkorona wurde mittels Formaldehydfixierung fixiert, um die ausgetauschte Soft-Proteinkorona während des Proteinkorona-