Descrizione del prompt

2.2 Elucidare i meccanismi molecolari chiave dell'azione della polifillina III su diversi sottotipi di cellule di cancro al seno. ① Sulla base dei precedenti risultati di differenza di sensibilità, selezionare quattro linee cellulari: MCF-7 (Luminal A), BT-474 (Luminal B), SK-BR-3 (HER2-arricchito) e MDA-MB-231 (TNBC). Utilizzare la tecnologia RNA-seq per confrontare sistematicamente le variazioni del trascrittoma di ciascun sottotipo prima e dopo il trattamento con polifillina III. Concentrarsi sull'arricchimento di apoptosi, stress ossidativo e vie di segnalazione specifiche del sottotipo (come ER, HER2, STAT3) e selezionare i geni chiave espressi in modo differenziale. Combinare Western blotting e qRT-PCR per verificare i cambiamenti di espressione dei target candidati (come i membri della famiglia Bcl-2, NOXA, PUMA, EGFR, p-STAT3, ecc.) e identificare le molecole effettrici principali con la risposta più significativa in ciascun sottotipo. ② Condurre esperimenti di intervento funzionale mirati ai meccanismi dominanti di ciascun sottotipo: in TNBC, impostare un gruppo di controllo, un gruppo polifillina III, un gruppo NAC (scavenger di ROS) e un gruppo polifillina III + NAC per rilevare l'apoptosi (Cleaved Caspase-3/PARP), i livelli di ROS, il potenziale di membrana mitocondriale e lo stato di fosforilazione di JNK/p38. Nelle cellule HER2⁺, impostare un gruppo di controllo, un gruppo polifillina III e un gruppo di sovraespressione/knockdown di HER2 per valutare l'attività della via HER2-AKT/ERK e il tasso di sopravvivenza cellulare. Nelle cellule Luminal A, combinare inibitori di ER (fulvestrant) o siRNA di ERα per osservare se la resistenza ai farmaci viene invertita. Allo stesso tempo, valutare i cambiamenti fenotipici funzionali attraverso citometria a flusso Annexin V/PI, analisi del ciclo cellulare ed esperimenti di scratch/Transwell. ③ Costruire linee cellulari stabili con knockout o sovraespressione di geni nodo chiave (come HIF-1α, STAT3 o HER2) per verificarne la necessità nella morte cellulare indotta da polifillina III, nell'inibizione del segnale e nei cambiamenti fenotipici, e rilevare l'ubiquitinazione delle proteine correlate o i cambiamenti di localizzazione subcellulare, stabilendo così l'asse del meccanismo molecolare centrale che guida le differenze di efficacia del farmaco in ciascun sottotipo.