Description du prompt

1. 动物模型构建与分组给药 1.1造模试剂准备 牛Ⅱ型胶原：需免疫级天然结构的胶原，冻干粉且纯度＞95%。 完全弗氏佐剂 冰醋酸：分析纯，溶剂胶原 1.2实验动物选择及伦理 选取Wistar雌性大鼠，6-8周龄，体重160-200g,(Wistar大鼠对胶原诱导的关节炎更敏感，发病率高，若没有Wistar大鼠，可用SD大鼠代替）。 每组10-12只，可能存在模型未成功的情况，造模组的数量可适当增加。 SPF级动物房，温度22±2°C，相对湿度55±5%，12h光照/黑暗循环，适应性喂养7d。动物实验开始前申请伦理。 1.3 CIA模型诱导方案 a.胶原溶液配制：在无菌条件下，将牛Ⅱ型胶原冻干粉溶解于0.05 M或0.1 M的冰醋酸中，终浓度为2 mg/mL。此步骤需在4°C下缓慢搅拌过夜，切勿剧烈震荡以防胶原变性。溶解后的胶原溶液应澄清透明或微带乳光。 b.乳剂制备：在冰浴条件下，将胶原溶液与等体积的完全弗氏佐剂混合，进行乳化（高速组织匀浆机或两支玻璃注射器通过三通阀反复推拉进行乳化） c.初次免疫：大鼠吸入麻醉（异氟烷）后，背部脱毛，消毒。注射部位：尾根部背侧皮内多点注射。 d.加强免疫：在初次免疫后第7天进行加强免疫，与初次免疫剂量相同，避开原注射点。 1.4 分组与给药方案 在初次免疫后第10-14天，大鼠开始出现关节红肿症状。此时根据关节炎评分或体重进行随机分组，以确保各组基线一致。 麻花艽提取物在100 mg/kg剂量下显示出显著的抗炎效果。为了观察明确的量效关系并覆盖代谢调节的阈值，设计100、200、400 mg/kg三个梯度。提取物需用0.5% 羧甲基纤维素钠溶液悬浮配制，从造模后第14天开始给药，持续治疗28天，至第42天结束。 组别 样本量 药品 剂量 给药途径/频率 空白对照组 10 0.9%生理盐水或0.5%CMC-Na 等体积 灌胃/每日1次 模型组 12 同上 等体积 灌胃/每日1次 阳性对照组 10 甲氨蝶呤 3mg/kg 灌胃/每周2次 麻花艽低剂量组 10 麻花艽乙醇提取物 100mg/kg 灌胃/每日1次 麻花艽中剂量组 10 麻花艽乙醇提取物 200mg/kg 灌胃/每日1次 麻花艽高剂量组 10 麻花艽乙醇提取物 400mg/kg 灌胃/每日1次 2. 药效评价部分 2.1 关节炎评分与肿胀度（宏观） a.观察频率：自造模之日起，每3-4天观察一次。 b.体重：监测大鼠体重变化。模型组通常因炎症消耗和疼痛导致体重增长缓慢甚至下降，药物治疗后应有所恢复。 c.关节炎指数：采用0-4分级评分法对四肢关节进行评分，总分0-16分。 0分：无红肿，关节外观正常。 1分：小趾关节轻度红肿。 2分：趾关节和足爪轻度红肿。 3分：足爪及踝关节中度红肿。 4分：足爪、踝关节严重红肿，甚至出现关节畸形或强直。 计算每一组的平均关节炎指数，绘制“时间-平均关节炎指数”曲线。 d.足趾容积/直径：使用足趾容积测量仪测量后肢排水体积，或使用数显游标卡尺测量踝关节横径。计算肿胀抑制率：抑制率（%）=（模型组均值-给药组均值）/（模型组均值-空白组均值）x100% 2.2 组织病理学检查（微观） 实验终点（第42天），处死大鼠，分离踝关节。 a.固定与脱钙：将踝关节浸泡于10%中性福尔马林固定48小时，随后置于10% EDTA脱钙液中，每3天换液一次，直至针刺无阻力（约需3-4周）。 b.包埋切片：梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度4-5μm。 c.HE染色：观察滑膜增生、炎性细胞浸润情况、血管翳形成。 2.3 炎症因子与信号通路 a.血清样本：实验结束前腹主动脉取血，分离血清。使用ELISA试剂盒检测全身性炎症标志物：TNF-α等 b.滑膜组织：去部分新鲜滑膜组织，液氮速冻。（wb检测炎症信号通路关键蛋白的表达） 3. 代谢组学部分样品采集 a.尿液样本：实验第41天，将大鼠置于代谢笼中，收集24小时尿液。收集管中预先加入0.05%-0.1%的叠氮化钠（NaN3）以抑制细菌生长。收集容器需置于冰袋包围中或4°C环境中。收集后立即测量体积，记录。3000 rpm离心10分钟去除沉淀和杂质。分装上清液，-80°C保存。 b.血清样本：腹主动脉取血，室温静置30-60分钟待血液凝固，3500 rpm 4°C离心15分钟，取上清（血清），分装冻存于-80°C。 c.处死后立即剖开膝关节和踝关节，剥离滑膜组织。用冰生理盐水快速漂洗去血污，滤纸吸干，放入冻存管，立即投入液氮速冻，随后转移至-80°C。 d.QC样本：从所有待测样品（血清、尿液、组织）中各吸取等量体积（如10 μL），混合均匀，分装。