Description du prompt

Établissement d'une plateforme technique : Marquage SILAC et méthodologie d'échange de la couronne protéique 1. Marquage SILAC des cellules : Tout d'abord, les cellules Raw 264.7 ont été marquées par SILAC en utilisant de la lysine et de l'arginine lourdes. Après cinq générations de culture, les cellules ont été fortement marquées. Par la suite, des lysats de cellules entières ont été extraits, et le succès du marquage isotopique a été confirmé par spectrométrie de masse. 2. Établissement d'une méthodologie d'échange de la couronne protéique : Une méthodologie a été établie pour analyser l'échange de la couronne protéique homogène et hétérogène. Deux types de nanoparticules (NPs Fe₃O₄@SiO₂ et NPs Fe₃O₄) ont été utilisés pour établir la méthodologie. Dans l'échange homogène, les nanoparticules ont d'abord été incubées avec un lysat cellulaire non marqué pendant 1 heure pour former la couronne protéique 1 (PC1). La PC1 a ensuite été transférée dans un lysat marqué lourdement et incubée pendant 1 heure pour former la couronne protéique 2 (PC2). Les protéines échangées de PC1 à PC2 ont été identifiées par spectrométrie de masse (en observant la proportion de protéines marquées lourdement). Dans l'échange hétérogène, les nanoparticules ont d'abord été incubées avec du sérum pour former la couronne protéique 1 (PC1). La PC1 a ensuite été transférée dans un lysat marqué lourdement pour former la couronne protéique 2 (PC2). Les protéines échangées de PC1 à PC2 ont été identifiées par spectrométrie de masse (en observant la proportion de protéines marquées lourdement). Les protéines de différents groupes d'échanges homogènes et hétérogènes ont été analysées, avec des groupes de contrôle constitués de nanoparticules incubées avec un lysat non marqué pour former une couronne protéique et de nanoparticules incubées avec du sérum pour former une couronne protéique. Application 1 : Analyse de la cinétique d'échange de la "couronne molle" et de la "couronne dure" à l'aide de la technologie de marquage de proximité 3. Le scénario d'application 1 consiste à combiner avec la technologie de marquage de proximité pour définir la "couronne molle" et la "couronne dure". Plus précisément, un groupe de contrôle a été mis en place pour identifier les protéines de la couronne dure échangées. Par exemple, dans l'échange homogène, les nanoparticules ont été incubées avec un lysat cellulaire non marqué pour former la couronne protéique 1, lavées deux fois avec un tampon pour éliminer les protéines de la couronne molle, puis la couronne dure lavée a été transférée dans un lysat marqué lourdement, incubée pendant 1 heure pour former la couronne protéique 2 (PC2), et lavée deux fois avec un tampon pour éliminer les protéines de la couronne molle. Par la suite, une spectrométrie de masse a été réalisée pour identifier les protéines de la couronne dure échangées. La même procédure a été effectuée dans le groupe hétérogène. Pour le groupe expérimental, un marquage de proximité a été effectué lors de la formation de la couronne protéique 2. Les nanoparticules ont d'abord été incubées avec un lysat cellulaire non marqué pour former la couronne protéique 1, puis un lysat marqué lourdement a été ajouté à la PC1. À différents moments d'incubation (5, 10, 20, 45, 60, 90, 120, 200, 300 s), le marquage de proximité a été initié (en ajoutant du phénol biotine et du peroxyde d'hydrogène). Des billes magnétiques SA ont été ajoutées pour enrichir les protéines biotinylées, suivies d'une analyse par spectrométrie de masse. Les protéines de la couronne dure échangées ont été suivies à différents moments. Des courbes de cinétique d'échange et des demi-vies ont été tracées pour chaque protéine. La distance de marquage du marquage de proximité a également été quantifiée. 4. De la description qualitative à l'analyse quantitative de la couronne protéique molle : L'analyse de la couronne protéique molle a été effectuée dans l'échange homogène. La couronne protéique molle a été fixée à l'aide d'une fixation au