Descripción del prompt

Establecimiento de la Plataforma Técnica: Marcaje SILAC y Metodología de Intercambio de Corona de Proteínas 1. Marcaje SILAC de Células: Primero, las células Raw 264.7 fueron marcadas con SILAC utilizando lisina y arginina pesadas. Después de cinco generaciones de cultivo, las células fueron fuertemente marcadas. Posteriormente, se extrajeron lisados de células enteras y se confirmó el éxito del marcaje isotópico mediante espectrometría de masas. 2. Establecimiento de la Metodología de Intercambio de Corona de Proteínas: Se estableció una metodología para analizar el intercambio de corona de proteínas tanto homogéneo como heterogéneo. Se utilizaron dos tipos de nanopartículas (NPs de Fe₃O₄@SiO₂ y NPs de Fe₃O₄) para establecer la metodología. En el intercambio homogéneo, las nanopartículas se incubaron primero con lisado celular no marcado durante 1 hora para formar la corona de proteínas 1 (PC1). La PC1 se transfirió luego a lisado marcado con isótopos pesados y se incubó durante 1 hora para formar la corona de proteínas 2 (PC2). Las proteínas intercambiadas de PC1 a PC2 se identificaron mediante espectrometría de masas (observando la proporción de proteínas marcadas con isótopos pesados). En el intercambio heterogéneo, las nanopartículas se incubaron primero con suero para formar la corona de proteínas 1 (PC1). La PC1 se transfirió luego a lisado marcado con isótopos pesados para formar la corona de proteínas 2 (PC2). Las proteínas intercambiadas de PC1 a PC2 se identificaron mediante espectrometría de masas (observando la proporción de proteínas marcadas con isótopos pesados). Se analizaron las proteínas de diferentes grupos de intercambios homogéneos y heterogéneos, con grupos de control que consistían en nanopartículas incubadas con lisado no marcado para formar una corona de proteínas y nanopartículas incubadas con suero para formar una corona de proteínas. Aplicación 1: Análisis de la Cinética de Intercambio de la "Corona Blanda" y la "Corona Dura" Utilizando la Tecnología de Marcaje por Proximidad 3. El escenario de aplicación 1 implica la combinación con la tecnología de marcaje por proximidad para definir la "corona blanda" y la "corona dura". Específicamente, se estableció un grupo de control para identificar las proteínas de la corona dura intercambiadas. Por ejemplo, en el intercambio homogéneo, las nanopartículas se incubaron con lisado celular no marcado para formar la corona de proteínas 1, se lavaron dos veces con tampón para eliminar las proteínas de la corona blanda, y luego la corona dura lavada se transfirió a lisado marcado con isótopos pesados, se incubó durante 1 hora para formar la corona de proteínas 2 (PC2) y se lavó dos veces con tampón para eliminar las proteínas de la corona blanda. Posteriormente, se realizó espectrometría de masas para identificar las proteínas de la corona dura intercambiadas. Se realizó el mismo procedimiento en el grupo heterogéneo. Para el grupo experimental, se realizó el marcaje por proximidad cuando se formó la corona de proteínas 2. Las nanopartículas se incubaron primero con lisado celular no marcado para formar la corona de proteínas 1, y luego se añadió lisado marcado con isótopos pesados a la PC1. En diferentes puntos de tiempo de incubación (5, 10, 20, 45, 60, 90, 120, 200, 300 s), se inició el marcaje por proximidad (añadiendo biotina fenol y peróxido de hidrógeno). Se añadieron perlas magnéticas SA para enriquecer las proteínas biotiniladas, seguido de análisis por espectrometría de masas. Se rastrearon las proteínas de la corona dura intercambiadas en diferentes puntos de tiempo. Se trazaron curvas cinéticas de intercambio y vidas medias para cada proteína. También se cuantificó la distancia de marcaje del marcaje por proximidad. 4. De la Descripción Cualitativa al Análisis Cuantitativo de la Corona de Proteínas Blanda: Se realizó un análisis de la corona de proteínas blanda en el intercambio homogéneo. La corona de proteínas blanda se fijó utilizando fijación con formaldehído para determinar la corona de proteínas blanda intercambiada durante el proceso de intercambio de la corona de proteínas. Específicamente, las nanopartículas se incubaron