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Hybridisierung von Nicotiana benthamiana Mutanten zur Erzeugung homozygoter Mutanten.

Biomedizinisch

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Hybridisierung von Nicotiana benthamiana Mutanten zur Erzeugung homozygoter Mutanten.

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Schematische Darstellung von vier Schlüsselgenen, die an Entgiftungs- und oxidative Stresswegen beteiligt sind, welche mit der Anfälligkeit für Prostatakrebs in Verbindung stehen. Die Abbildung hebt TXNRD2 als das Hauptkandidatengen hervor, das an der mitochondrialen Redox-Homöostase und der Kontrolle oxidativer Schäden beteiligt ist und Evidenz für eine Assoziation in einer unabhängigen Replikationskohorte zeigt. NFE2L2 (NRF2) wird als Hauptregulator der antioxidativen Antwort dargestellt; reduzierte Expression in Prostatatumorgewebe führt zu einer beeinträchtigten Aktivierung zytoprotektiver Gene. ARNT wird als transkriptioneller Cofaktor in Xenobiotika-Entgiftungs- und Hypoxie-bezogenen Signalwegen dargestellt, der potenziell die Angiogenese und metabolische Reprogrammierung bei Prostatakrebs beeinflusst. GPX6 ist als Selenoprotein enthalten, das an der Peroxid-Entgiftung und Redox-Signalisierung beteiligt ist, mit einer eher explorativen Rolle bei Prostatakrebs. Insgesamt veranschaulicht die Abbildung die Konvergenz dieser Gene auf die Kontrolle von oxidativem Stress und Entgiftungsprozessen, die für Prostatakrebs relevant sind.

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Das konstruierte rekombinante Plasmid wird in E. coli Wirtsstämme eingebracht. Häufig verwendete Wirtsstämme wie BL21(DE3) oder DH5α werden verwendet, und das rekombinante Plasmid wird durch Hitzeschock oder Elektroporation in die Bakterienzellen eingebracht. Nachdem das Plasmid in die Zellen gelangt ist, wird die Bakterienlösung kultiviert und resistente Kolonien werden selektiert, um die erfolgreiche Transformation zu bestätigen. Anschließend wird der rekombinante Stamm in großem Maßstab in einem Nährmedium kultiviert.

Während der Expressionsphase wird ein Induktor hinzugefügt, um die Proteinexpression zu initiieren. Beispielsweise kann das häufig verwendete IPTG die effiziente Expression von Genen mit dem T7-Promotor induzieren; frühe Produktionsmethoden verwendeten auch den Tryptophan-Promotor (trp-Promotor), der den Insulinvorläufer nach Tryptophanverarmung automatisch exprimiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass durch Optimierung der Expressionsbedingungen und der Nährmediumzusammensetzung hohe Mengen an Insulin A-Kette und B-Kette (oder Vorläuferprotein) in E. coli erhalten werden können.

Das konstruierte rekombinante Plasmid wird in E. coli Wirtss...

Die Herstellung von rekombinantem humanem Insulin beginnt mit dem Design und der Synthese des humanen Insulin-Gens. Humanes Insulin besteht aus zwei Peptidketten, A und B; daher werden typischerweise zwei synthetische Gene entworfen: eines, das die A-Kette kodiert, und eines, das die B-Kette kodiert. Forscher optimieren *E. coli*-bevorzugte Codons basierend auf der natürlichen Insulin-Aminosäuresequenz und synthetisieren diese beiden Gensegmente chemisch. Anschließend werden Restriktionsenzyme verwendet, um das A-Ketten- oder B-Ketten-Gen in ein Vektorplasmid zu inserieren, wodurch ein rekombinantes Expressionsplasmid konstruiert wird. Das Plasmid muss auch funktionelle Elemente wie Promotoren und Terminatoren sowie Antibiotikaresistenzmarker enthalten, um eine effiziente Gentranskription und Selektion zu erreichen. Häufig verwendete Expressionsvektoren tragen im Allgemeinen starke Promotoren (wie T7- oder Tryptophan-Promotoren) und RBS, um eine hocheffiziente Expression des inserierten Gens in den Wirtsbakterien anzutreiben.

Hier werden die A- und B-Gene separat in zirkuläre Plasmide kloniert. Wie in der Abbildung dargestellt, wird das Proinsulin-Gen (das A- und B-Kettensequenzen enthält) oben links aus dem Zellkern extrahiert; das mit Restriktionsenzymen geöffnete zirkuläre Plasmid befindet sich oben rechts, und der Vektor enthält einen Promotor und ein Resistenzgen. Nach der enzymatischen Reaktion werden das A-Ketten-Gen und das B-Ketten-Gen an verschiedene Stellen auf dem Plasmid ligiert, wodurch ein rekombinantes Plasmid für die nachgeschaltete Expression entsteht.

Die Herstellung von rekombinantem humanem Insulin beginnt mi...

Fortschritte in der Neurowissenschaft.

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