**Titel:** Aufschlüsselung von Wirtsprotein-Interaktionen, die den lysosomalen LNP-Escape durch Proximity-Labeling-Technologie vermitteln **Wichtige wissenschaftliche Fragen:** 1. Wie beeinflussen die Lipidkomponenten von LNPs spezifisch ihre lysosomale Escape-Effizienz? Gibt es wichtige Lipidstrukturmerkmale, die die Escape-Effizienz bestimmen? 2. Welche Wirtszellproteine interagieren funktionell mit LNPs an den kritischen spatiotemporalen Knotenpunkten des lysosomalen Escapes? Wie vermitteln oder behindern diese interagierenden Proteine den Escape-Prozess? **Forschungsmethoden:** Zunächst wird eine Multikomponenten-Lipidbibliothek erstellt und in LLC-luc-Zellen unter Verwendung des Siluc-Reportersystems gescreent, um "High-Escape"- und "Low-Escape"-LNPs mit signifikant unterschiedlichen lysosomalen Escape-Effizienzen zu identifizieren. Die subzelluläre Lokalisierung von LNPs wird dynamisch mittels konfokaler Mikroskopie verfolgt, um ihr Escape-Zeitfenster präzise zu bestimmen. Anschließend wird zum kritischen Zeitpunkt des Escapes die Ce6-photoaktivierte Proximity-Labeling-Technologie verwendet, um Wirtsproteine räumlich und zeitlich in der Nähe von LNPs zu markieren, und interagierende Proteingruppen werden durch Massenspektrometrie-Analyse identifiziert. Kandidaten für regulatorische Proteine werden durch Vergleich der differentiell interagierenden Proteine von High- und Low-Escape-LNPs gescreent. Schließlich wird die CRISPR-Cas9-Gen-Knockout-Technologie verwendet, um die funktionelle Rolle von Schlüsselproteinen beim lysosomalen LNP-Escape zu verifizieren. **Erwartete Schlussfolgerungen:** Es wird erwartet, dass diese Studie eine direkte Korrelationskarte zwischen der LNP-Lipidzusammensetzung und der lysosomalen Escape-Effizienz erstellt und wichtige chemische Lipidmerkmale aufdeckt, die die Escape-Effizienz beeinflussen. Zum ersten Mal wird das dynamische Interaktionsnetzwerk zwischen LNPs und Wirtsproteinen am präzisen spatiotemporalen Knotenpunkt des lysosomalen Escapes erfasst, und mehrere wichtige Wirtsfaktoren (wie z. B. spezifische Membranfusionsproteine, Lipidtransferproteine oder Ionenkanäle), die den Escape-Prozess vermitteln oder behindern, werden identifiziert. Diese Ergebnisse werden den molekularen Mechanismus des lysosomalen LNP-Escapes aufklären, eine theoretische Grundlage und neue Engineering-Ziele für das rationale Design effizienter Verabreichungssysteme liefern und die Entwicklung der Nukleinsäure-Wirkstoffverabreichungstechnologie fördern.
